Autor: Ing. Ariel D. Arencibia Rodríguez

Lugar de nacimiento: Matanzas, Cuba

Fecha de nacimiento: 19 de diciembre de 1963

Categoría Científica: Investigador Titular

Centro de trabajo: Sede Central INICA

Cargo Actual: Investigador Titular

Año de defensa: 1997

País donde defendió: Cuba

Tutor: Dra. C. María Teresa Cornide Hernández, Profesora e Investigadora Titular. CNIC. Ciudad Habana Cuba

Consultante: Dr. C. Francesco Sala, Profesor e Investigador Titular. Universidad de Milán. Italia

METODOLOGÍA PARA LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE LA CAÑA DE AZÚCAR (SACCHARUM SPP.): PRODUCCIÓN DE PLANTAS RESISTENTES AL ATAQUE DEL BÓRER (DIATRAEA SACCHARALIS FAB.).

Síntesis

Se describe por primera vez una metodología para la transformación directa de la caña de azúcar Saccharum spp.) basada en la electroporación de células intactas, la cual ha abierto las puertas al mejoramiento mediante Ingeniería Genética de la caña de azúcar y quedará disponible para la producción de plantas transgénicas que permitirán un manejo integrado de nuestro principal cultivo. La utilidad de la misma se demostró en la transformación de la variedad comercial Ja 60-5 con el gen exógeno cryIA(b) . Este gen fue aislado de la bacteria Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 y codifica una proteína que tiene propiedad entomocida contra el bórer de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis Fab.). Este trabajo parte de la base de estudios previos en los cuales se demostró que el cultivo y regeneración de protoplastos de variedades comerciales de caña de azúcar es un evento de muy baja eficiencia, poca reproducibilidad y alta dependencia del genotipo, por lo cual se establecieron las condiciones para la transformación directa de explantes potencialmente embriogénicos obtenidos de: a- Zona basal de plantas in vitro compuesta mayoritariamente por tejidos meristemáticos; b- Células de callos con alto potencial de regeneración. Las condiciones de transformación de células intactas, selección y regeneración de plantas a partir de ambos materiales iniciales fueron establecidas y se demostró la integración y expresión del gen reportero uidA en plantas transgénicas. Ambos resultados constituyen los primeros reportes mundiales de transformación de la caña de azúcar mediante electroporación de células intactas y uno de los primeros en la transgénesis de Gramíneas por esta metodología. Por considerarse más eficiente, se escaló la metodología de co-electroporación (Btk-uidA) de células provenientes de callos embriogénicos, para la obtención de plantas autopesticidas de la variedad Ja 60-5. Previamente fue comprobada en dietas artificiales la actividad biológica específica contra el borer de la proteína recCryIA(b). La selección de los callos y plantas transgénicas se realizó mediante el método histoquímico GUS. La eliminación de la plantas mosaicos se realizó a través de tres etapas sucesivas de micropropagación in vitro , hecho que se comprobó por tinción GUS en diferentes partes de las mismas. La selección de los individuos resistentes al borer se hizo mediante un ensayo primario de actividad biológica in vitro . Este constituyó un método práctico establecido por primera vez en el mundo y consistió en la inoculación de larvas de bórer (1º-2º estadio) a cada una de las plantas transgénicas micropropagadas. Se detectaron 41 plantas resistentes al ataque del insecto a partir de 2390 plantas analizadas, con una efectividad de 83.3% demostrada mediante RCP (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Los clones tolerantes al bórer fueron adaptados a condiciones ambientales en casas de cultivo y posteriormente se trasplantaron a la parcela experimental según un diseño completamente aleatorizado. Cada parcela tenía un surco de 20 m de largo y la distancia entre estos fue de 1.6 m. Se utilizaron como controles surcos alternos de plantas del genotipo donante Ja60-5 provenientes de cultivo in vitro y de propagación agámica del Banco de Germoplasma de la EPICA Matanzas. El experimento tuvo 4 surcos de bordes de plantas de la variedad susceptible al borer POJ2878, utilizado además como contención biológica a posibles escapes de insectos. A los dos meses de edad las poblaciones fueron inoculadas con larvas (1º-2º estadio) mantenidas en cría artificial y después de 30 días el experimento fue evaluado. Se seleccionaron 5 clones (4-3.1; 48-1.3; 56-1.5; 65-2.2; 209-1.4) con niveles de resistencia al ataque del insecto determinados por los índices de infestación (I.I): 9; 6; 0; 3 y 4 respectivamente. En estos se demostró molecularmente tanto la presencia del gen cryIA(b) , como la expresión y cuantificación de la d -endotoxina recCryIA(b). El análisis poblacional después de la infección artificial de bórer, demostró un aumento significativo de las varianzas fenotípicas en las poblaciones transgénicas. Parte de este aumento puede considerarse producto de la variabilidad genética introducida mediante Ingeniería Genética. Estos clones son las primeras plantas de caña de azúcar obtenidas a nivel mundial con actividad larvicida contra el bórer. Posteriormente se utilizaron por primera vez en el mundo las técnicas de AFPLs (Amplificación de Fragmentos Polimórficos por su Longitud) y AFPMs (Amplificación de Fragmentos Polimórficos mediante Microsatélites) para estudiar la variabilidad genética en plantas transgénicas. Se exploraron aproximadamente 816 019 pb del genoma de la caña de azúcar y se detectaron 51 bandas polimórficas. El índice de polimorfismo genético (introducido por primera vez para poder comparar plantas transformadas por diferentes vías y analizadas por diferentes métodos), permite asegurar que la electroporación de células intactas puede producir variaciones somaclonales a bajos niveles, lo cual valida a este método para la producción comercial de futuras plantas transgénicas. El conocimiento de la variabilidad genética inducida por determinado método de transformación, permitirá un manejo adecuado del número de clones que deberán ser llevados al campo para las pruebas de actividad biológica y su posterior selección en base a las variaciones somaclonales, considerando que estas últimas en algunos casos pudieran ser de interés agronómico y por tanto contribuir adicionalmente al mejoramiento genético. Por su parte, la identificación de los transgenes resistentes al borer puede realizarse mediante los marcadores moleculares R4; R5, R19 (obtenidos mediante AFPMs) y A29; A31 (mediante AFPLs) de acuerdo al resultado de 8 análisis de correspondencia simple, lo cual ha constituido un valioso instrumento para su protección legal en Cuba. Debido a la demostración de la presencia de variaciones somaclonales por métodos estadísticos, moleculares y botánicos (se observaron variaciones en características utilizados para la clasificación de variedades en la caña de azúcar), podemos afirmar que los clones transgénicos objeto de este trabajo son genotipos nuevos, homogéneos y distinguibles en condiciones de campo, que permiten concluir que estamos en presencia de variedades esencialmente derivadas del donante Ja60-5, ya que mantienen sus cualidades agrícolas e industriales y expresan el carácter introducido para la resistencia al ataque del bórer. Los clones resistentes al bórer 4-3.1; 48-1.3; 56-1.5; 65-2.2 y 209-1.4, aunque no alcanzan altos niveles de expresión del gen foráneo, han ofrecido resultados agronómicos que podrían permitir su utilización en un manejo integrado para el control al bórer. Estos tendrán un gran valor metodológico y estratégico ya que constituyen las primeras plantas transgénicas autopesticidas de caña de azúcar en el mundo, que han sido evaluadas integralmente y liberadas a condiciones ambientales. Los mismos serán material de estudio en los análisis de riesgos sobre el impacto ecológico de OGMs (Organismos Genéticamente Modificados) en Cuba según las normativas de bioseguridad del CIGB - CITMA.

Methodology for the genetic transformation of sugar cane (Saccharum spp.): production of resistant plants to borer attack (Diatraea saccharalis Fab.)

Summary

For first time it is described a methodology for direct transfomation of sugarcane (Saccharum spp.) based on the electroporation of intact cells, which has opened the way to plant improvement by means of sugarcane Genetic Engineering and it will be available for the production of transgenic plants that will allow an integrated handling of our main crop. The utility of the same one was demonstrated in the commercial variety Ja60-5 transformation with the exogenous gene cryIA(b). This gene was isolated from the bacteria Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 and it codes a protein that has entomocide property against sugarcane borer (Diatraea saccharalis Fab.). This work is based on previous studies in which was demonstrated that protoplasts cultivation and regeneration of commercial sugarcane varieties is an event of very low efficiency, little reproductively and genotype-high dependence, reason why the conditions settled down for the direct transformation of explants potentially embryogenics obtained by means of: a - basal area of plants in vitro compound mostly by meristematic tissues; b - Callus cells with high regeneration potential. The conditions of intact cells transformation, selection and regeneration of plants starting from both initial materials were established and it was demonstrated the gene reporter uidA integration and expression in transgenic plants. Both results constitute the first sugarcane transformation world reports by means of intact cells electroporation and one of the first ones in the transgenisis of Gramineous for this methodology. To be considered more efficient, was scaled cells the co-electroporation methodology (Btk-uidA) coming from embryogenic cells, for auto-pesticide plants obtaining from variety Ja60-5. Previously it, was checked in artificial diets the specific biological activity against the protein's recCryIA(b) borer. Callus and plants transgenic selection was carried out by means of histo-chemical method GUS. The elimination of mosaic plants was realized through three successive stages of micro-propagation in vitro , what was proven for tint GUS in different parts of the same ones. The individual selections of borer resistant plants were made by means of a primary biological activity essay in vitro . This constituted a practical method settled down for first time in the world and it consisted on the inoculation of borer larvae (1º-2º stadium) to each of transgenic micro-propagated plants. Forty-one resistant plants were detected to insect attack from 2390 analyzed plants, with an effectiveness of 83.3% demonstrated by means of RCP (Polymerasa's reaction in chain). Borer tolerant clones were adapted to environmental conditions at greenhouse and later transplanted to experimental plot according to a random design. Each plot had one row of 20 m long and the distance among these was 1.6 m . Donating genotype Ja60-5 coming from culture tissue and agamic propagation of EPICA Matanzas Germ plasm Bank were used like nil alternating rows. The experiment had 4 border rows of borer-susceptible sugarcane variety POJ2878, also used as biological contention to possible escapes of insects. Two-months age populations were inoculated with larvae (1º-2º stadium) maintained in artificial breeding and after 30 days the experiment was evaluated. Five clones were selected (4-3.1; 48-1.3; 56-1.5; 65-2.2; 209-1.4) with resistance levels to the insect attack determined by infestation indexes (I.I): 9; 6; 0; 3 and 4, respectively. In these, the presence of the gene cryIA(b) was demonstrated molecularly as the expression and quantification of the endo-toxin recCryIA(b). The population analysis after borer's artificial infection, demonstrated a significant increase of phenotypic variances in transgenic populations. Part of this increase can be considered product of genetic variability introduced by means of Genetic Engineering. These clones are the first plants of sugarcane obtained at world level with larvicide activity against borer. Later on they were used for first time in the world the techniques of AFPLs (Amplification of Polymorphic Fragments for their Longitude) and AFPMs (Amplification of Polymorphic Fragments by means of Micro-satellites) to study the genetic variability in transgenic plants. They were explored 816 019 pb of sugarcane approximately and 51 bands polymorphic were detected. The index of genetic polymorphism (introduced for first time to be able to compare transformed plants by different ways and analyzed by different methods), it allows assuring that the electroporation of intact cells can produce soma-clone variations to low levels, validating this method for the commercial production of future transgenic plants. The knowledge of induced genetic variability by certain transformation method, will allow an appropriate handling of clones number that they will be taken to the field for the biological activity tests and its later selection based on the soma clone variations, considering that last ones in some cases could being of agronomic interest and therefore to contribute additionally to the genetic improvement. On the other hand, the identification of borer transgenic resistant can be carried out by means of molecular markers R4; R5, R19 (obtained by means of AFPMs) and A29; A31 (by means of AFPLs) according to the result of 8 analysis of simple correspondence, what have constituted a valuable instrument for its legal protection in Cuba . Due to the presence of variations soma-clones demonstration for statistical, molecular and botanical methods (variations were observed in characteristics used for sugarcane varieties classification), we can affirm that the transgenic clones object of this work are new genotypes, homogeneous and distinguishable under field conditions allowing to conclude we are in presence of essentially derived varieties from donating Ja60-5, since they maintain their agricultural and industrial qualities and express the character introduced for the resistance to borer attack. The resistant clones to the borer 4-3.1; 48-1.3; 56-1.5; 65-2.2 and 209-1.4, although they don't reach strange gene high expression levels, they have offered agronomic results that could allow their use in an integrated management of borer control. These will have a great methodological and strategic value since they constitute the first transgenic plants auto-pesticides of sugarcane in the world that have been evaluated integrally and liberated to environmental conditions. The same ones will be material of study in the risk analyses on the ecological impact of OGMs (Organisms Modified Genetically) in Cuba according to the CIGB - CITMA bio-security normative.